Аналитическая и трансляционная геномика
Общий ресурс аналитической и трансляционной геномики (ATG) предоставляет секвенирование нового поколения и другие услуги, связанные с геномикой, для членов Онкологического центра ЕНД и других пользователей в ЕНД и дочерних учреждениях. Основные услуги включают в себя секвенирование следующего поколения с использованием двух инструментов Ion Proton S5/XL и связанную с этим экспертную поддержку в области биоинформатики. К ним относятся обычная «объемная» секвенирование РНК, секвенирование РНК отдельных клеток с использованием системы 10x Genomics, целевое секвенирование ДНК, ChIP-seq и множество других анализов, многие из которых можно проводить как с живыми, так и с замороженными клетками или тканями. или заархивированные (например, FFPE) образцы. Секвенатор Singular Genomics G4 обеспечивает секвенирование следующего поколения в гибком и быстром формате, подходящем для всех типов анализов секвенирования РНК и ДНК. Приборы Ion Proton S5/XL особенно подходят для анализа РНК низкого качества, например, из материала FFPE, анализ которого с помощью других технологий затруднен или невозможен. Приборы генерируют до 100 миллионов считываний на чип секвенирования, и мы стремимся обеспечить быстрый оборот, если это возможно.
Общий ресурс поддерживается онкологическим центром UNM, включая основной грант CCSG P30CA118100 и другие фонды, а также за счет средств штата NM и сборов с пользователей.
Специалисты доступны для консультаций, чтобы помочь пользователям разработать наилучшие возможные эксперименты, чтобы максимально повысить качество получаемых данных.
Директор факультета
Скотт А. Несс, К.т.н.
Профессор, терапевт/ Молекулярная медицина
Кабинет: CRF 121; Тел .: (505) 272-9883
Технический директор / Биоинформатика
Кэтрин (Чарли) Брейер, доктор философии
Старший технический персонал
Кел Кук CRF 118 Тел .: (505) 272-5564
Дженнифер Вудс CRF 121 Тел .: (505) 272-3464
Мэгги Сайфери CRF 121 Тел .: (505) 272-2464
Аналитическая и трансляционная геномика
ATG доступен для использования всеми исследователями UNM и связанных с ним организаций.
Чтобы подтвердить использование этого общего ресурса, пожалуйста, включите в свои публикации следующее:
Это исследование было частично поддержано грантом NCI P30CA118100 Универсального онкологического центра UNM и использовало Общий ресурс по аналитической и трансляционной геномике, который получает дополнительную поддержку от штата Нью-Мексико.
Услуги ATG более подробно описаны ниже.
Эпоха Ресурс по аналитической и трансляционной геномике в первую очередь предоставляет технологии секвенирования следующего поколения, такие как RNA-seq, секвенирование целевой генной панели и эпигенетические анализы, такие как ChIP-seq и ATAC-seq, в сочетании с экспертным биоинформационным анализом. Также доступны услуги ПЦР в реальном времени. Общий ресурс ATG доступен для использования всеми преподавателями UNM и его филиалов, и всем исследователям рекомендуется связаться с нами, чтобы узнать, как мы можем помочь в их исследованиях.
10-кратное геномное секвенирование отдельных клеток: Предлагается передовое секвенирование отдельных клеток с использованием системы 10x Genomics, которая хорошо работает как с живыми клетками, так и с изолированными ядрами из замороженных образцов.
Секвенирование парных концов Singular Genomics G4: Гибкий и быстрый инструмент для секвенирования всех типов секвенирования следующего поколения, включая секвенирование РНК, ChIP-seq, секвенирование всего экзома (WES) или секвенирование всего генома (WGS). Большинство библиотек, подготовленных для секвенирования Illumina, можно быстро и эффективно преобразовать для анализа на G4.
Illumina секвенирование: У ATG есть контракт с Genomics Core в Университете Колорадо, Аншутц, на секвенирование Illumina с использованием их инструмента NovaSeq. ATG может подготовить библиотеки и отправить их в UofCO для секвенирования или отправить туда образцы для подготовки библиотеки и секвенирования. После этого данные загружаются в нашу веб-учетную запись AWS для анализа данных.
Ion Torrent Секвенирование нового поколения: Мощные полупроводниковые инструменты для секвенирования Life Technologies Ion Proton S5/XL идеально подходят для анализов секвенирования следующего поколения, включая анализы экспрессии генов (RNA-seq), эпигенетические анализы (ChIP-seq) и целевое секвенирование (комплексная онкологическая панель Ion Ampliseq) рака. соответствующие гены, даже из образцов FFPE.
Экспертный анализ данных биоинформатики: Сотрудники ATG Shared Resource используют сложные методы анализа данных для анализа экспрессии генов и данных генотипирования и стремятся предоставить нашим пользователям данные о качестве публикаций для их рукописей или заявок на гранты. Мы используем программные пакеты R/Bioconductor для изучения больших и сложных наборов данных, полученных методами геномики.
Применение секвенирования нового поколения
Секвенирование следующего поколения (массовое параллелизм) полезно для множества экспериментальных подходов. Это не замена нормальному (по Сэнгеру) секвенированию плазмид или продуктов ПЦР. Вместо этого секвенирование следующего поколения основано на захвате миллионов или миллиардов отдельных молекул ДНК (например, фрагментов геномной ДНК, кДНК), которые затем амплифицируются отдельно и секвенируются параллельно, генерируя миллионы или миллиарды «считываний» секвенирования, каждое из которых происходит из другая молекула шаблона. Это похоже на индивидуальное клонирование и секвенирование миллионов или миллиардов независимых фрагментов ДНК, но все это происходит сразу и всего за несколько дней.
Следующие типы научных приложений легко адаптируются к подходам секвенирования следующего поколения:
- Целевое секвенирование генов, связанных с раком или заболеванием, на панели генов
- Исследования экспрессии генов с использованием секвенирования РНК
- Иммунопреципитация хроматина - секвенирование (ChIP-seq) для исследования факторов транскрипции или эпигенетических исследований
- Исследования метилирования ДНК (например, RRBS)
- Секвенирование транскриптома (например, идентификация РНК с альтернативными добавками)
- Анализ некодирующих РНК (ncRNAs, lincRNAs, miRs)
В настоящее время предприятие ATG имеет или имеет доступ к нескольким типам инструментов секвенирования следующего поколения:
- Сингулярная геномика G4: Быстрое и гибкое секвенирование парных концов (аналог Illumina NextSeq)
- ТермоФишер Ион S5/XL: Твердотельные NGS, генерирующие до 120 миллионов операций чтения на чип
- Illumina секвенирование (NovaSeq и NextSeq) через наших партнеров в Univ of CO, Anschutz
- 10x контроллер Genomics Chromium: для одноклеточных анализов RNA-seq и ATAC-seq
Эти инструменты обеспечивают экономичное и быстрое секвенирование нового поколения для всех типов анализов секвенирования нового поколения.
Общие инструменты доступны с понедельника по пятницу с 8:30 до 5:XNUMX.
(другое время может быть доступно по специальной договоренности)
У ATG есть несколько уникальных инструментов, которые могут использовать исследователи UNM. Квалифицированные лаборатории вносят ежегодную абонентскую плату и проходят обучение и поддержку со стороны персонала ATG. Приборы доступны для использования в учреждении в обычное рабочее время.
Биоанализатор Agilent: Важный инструмент для молекулярных биологов, заменяет гель-электрофорез во многих областях. Это особенно полезно для анализа качества и / или количества образцов РНК или ДНК с использованием очень небольшого количества материала вместо обработки большого количества ценных образцов на геле.
Спектрофотометр Nanodrop: Спектрофотометр капель, который измеряет оптическую плотность небольшой капли образца. Это избавляет от необходимости разводить образцы в большие кюветы.
Thermo Fisher Cell Coutess II: для количественного определения живых клеток в образце.
Октодиссоциатор Milteny softMACS Octo с нагревателями: Для диссоциации образцов тканей перед секвенированием.
Кубит флуорометр: для количественного определения РНК и ДНК
Пожалуйста, свяжитесь с персоналом ATG Facility для получения дополнительной информации об анализах и ценах.
Используйте наш сайт iLab для оговорки и цитаты. (Требуется вход в систему)
Общий ресурс аналитической и трансляционной геномики (ATG) (ранее Keck-UNM Genomics Resource, KUGR) обеспечивает доступ к анализам секвенирования следующего поколения, микрочипам и другим технологиям геномики в сочетании с экспертным биоинформатическим анализом. ATG доступен для использования всеми преподавателями UNM и его филиалов, и всем исследователям рекомендуется связаться с ATG, чтобы узнать, как мы можем помочь в их исследованиях.
По вопросам относительно iLabs или для настройки учетной записи/PR для использования в общем ресурсе, пожалуйста электронная почта Мэри Шерман или позвоните по телефону 505-272-4539.
Заполнить эта смарт-таблица форма чтобы начать свой проект.
(Форма откроется в новой вкладке. Если это не так, скопируйте и вставьте этот текст в адресную строку новой вкладки вашего браузера: https://app.smartsheet.com/b/form/fa518ed260454445bec9d3bc34cac4cf)
Часто задаваемые вопросы по ATG
Это руководство для исследователей, рассматривающих возможность использования сервисов секвенирования следующего поколения (NGS) из общего ресурса ATG. Всем исследователям рекомендуется проконсультироваться с персоналом ATG перед началом подготовки или анализа образцов. Мы можем помочь с экспериментальным дизайном и, при необходимости, свяжем вас с экспертами-биостатистами, которые помогут с экспериментальным дизайном. Перед началом экспериментов с NGS очень важно продумать план эксперимента, который может быть довольно дорогостоящим.
RNA-seq может быть успешно выполнен с очень небольшими количествами РНК. Однако требуемое количество зависит от требуемой «глубины считывания» и от того, будет ли загрязнение рибосомной РНК. Рибосомная РНК составляет 90% РНК в клетках, поэтому перед выполнением RNA-seq необходимо удалить или уменьшить рибосомную РНК. Это можно сделать двумя способами: физическое удаление посредством «рибодеплеции», при котором биотинилированные зонды, комплементарные рибосомным РНК, гибридизуются с образцами РНК, затем комплексы захватываются и удаляются. В качестве альтернативы можно использовать метод подготовки библиотеки, направленной на поли-А (например, Smart-Seq), который позволяет избежать секвенирования рибосомной РНК, но исключает другие РНК, у которых отсутствуют хвосты поли-А и которые могут представлять интерес (например, микроРНК). Пожалуйста, свяжитесь с персоналом ATG Shared Resource, чтобы обсудить варианты, прежде чем начинать эксперименты.
Общий ресурс ATG выполняет полный анализ NGS услуг. Однако из-за сложности подготовки библиотеки NGS то, что может предоставить ATG, зависит от типа эксперимента. Для целевого секвенирования панелей и секвенирования экзома нам нужны только образцы ДНК, и мы создадим библиотеки, проведем секвенирование и первоначальный анализ. Перед началом работ мы сообщим предполагаемую стоимость. Для RNA-seq и других подходов существует множество вариантов построения библиотек. Мы настоятельно рекомендуем пользователям связаться с персоналом ATG, чтобы обсудить варианты, прежде чем начать. Помимо полной системы Affymetrix, в ATG Shared Resource есть спектрометр Nanodrop для количественного определения РНК в небольших объемах и Agilent Bioanalyzer для быстрого анализа качества и количества образцов РНК или ДНК.
Эксперименты NGS могут быть дорогими. Общая стоимость большинства крупных экспериментов (секвенирование экзома, секвенирование РНК и т. Д.) Составляет от 500 до 800 долларов за образец, плюс плата за биоинформатику. Некоторые небольшие целевые эксперименты по секвенированию стоят меньше за образец. Пожалуйста, свяжитесь с персоналом для получения дополнительной информации и расценок.
Да! Эксперименты NGS генерируют большие сложные наборы данных. Биоинформатический анализ невозможен без дубликатов. Лучше в трех экземплярах. Реплики действительно необходимы для получения хороших результатов, значимых и стоящих своих затрат.
Общий ресурс ATG следует строгим руководящим принципам контроля качества и стандартным рабочим процедурам, чтобы гарантировать, что данные имеют высочайшее качество и соответствуют или превосходят стандарты, установленные такими группами, как консорциум ENCODE. Мы используем стандартные дополнительные средства контроля для мониторинга внутренних процессов и выполнения проверок контроля качества на всех этапах производства и секвенирования библиотек. Пожалуйста, свяжитесь с персоналом ATG, чтобы увидеть примеры данных, которые мы успешно подготовили.
Качество исходных образцов РНК будет подтверждено с помощью Agilent BioAnalyzer или с помощью ПЦР в реальном времени. Перед секвенированием библиотеки будут проверены аналогичным образом. Дополнительные элементы управления добавляются на нескольких этапах для мониторинга внутреннего контроля качества.
Анализы NGS производят большие сложные наборы данных, которые содержат огромное количество информации, но также могут быть трудными для анализа. Общий ресурс ATG обеспечивает первый уровень анализа, включая анализ параметров контроля качества, сопоставление считываний с соответствующим геномом, идентификацию вариантов последовательностей или подсчет признаков, в зависимости от ситуации, и выполнение простых типов интерпретации, таких как создание тепловых карт. для RNA-seq. Однако более сложные типы анализа данных, такие как сопоставление результатов с информацией о пациентах, должны выполняться с привлечением экспертов из общих ресурсов биоинформатики или общих ресурсов биостатистики. Персонал ATG может помочь наладить взаимодействие с соответствующими экспертами, которые должны быть задействованы с самого начала, чтобы помочь с экспериментальным дизайном и контролем качества.
Существует вероятность того, что сложный процесс, связанный с генерацией данных NGS, приведет к «дневному эффекту» или «пакетному эффекту», при котором образцы обрабатываются или анализируются вместе в одном кластере данных. Это хорошо известный артефакт многомерного анализа данных, и мы включаем дополнительные элементы управления, которые помогают нам выявлять и устранять эти типы проблем с данными.
В ATG Shared Resource есть команда экспертов по биоинформатике, которые будут выполнять первоначальный анализ данных, а также управлять данными и создавать резервные копии. Они могут выполнять самые простые типы анализов (например, экспрессия генов из последовательности РНК). Однако сложные или специализированные типы анализа потребуют участия дополнительных экспертов из общих ресурсов биостатистики или биоинформатики. Персонал ATG может помочь наладить необходимое сотрудничество.
Верификация - важная часть каждого эксперимента NGS, и требования меняются в зависимости от типа эксперимента. Пожалуйста, свяжитесь с персоналом ATG, чтобы обсудить варианты проверки результатов NGS.
Директор объекта, Скотт А. Несс, доктор философии., может предоставить письма поддержки и советы о том, как описать общий ресурс ATG и возможные эксперименты с NGS в заявках на гранты. Доктор Несс работал в многочисленных исследовательских секциях NIH, ACS и DOD и рассмотрел множество заявок на гранты, которые включают эксперименты NGS. В его собственных финансируемых грантах есть эксперименты с NGS. Он может помочь с написанием разделов вашего гранта, касающихся экспериментов с NGS, и может указать на потенциальные ловушки и вещи, которых следует избегать.
Самый простой способ критиковать эксперимент NGS - описать его как рыбалку. Вот некоторых вещей, которых следует обязательно избегать.
- Не предлагайте характеризовать гены, которые вы еще не идентифицировали. Если у вас нет предварительных данных, вы не знаете, какие гены или сколько генов вы найдете. Однако их, скорее всего, будут сотни. Просто сказать, что вы выберете несколько интересных генов для изучения, - это быстрый способ получить плохую оценку вашего гранта. Если возможно, ваш эксперимент должен проверить гипотезу. Например, вы можете выдвинуть гипотезу, что определенные гены (например, гены апоптоза) будут индуцированы. Затем вы можете предложить использовать тесты NGS для проверки (и предложить ПЦР в реальном времени в качестве резервного подхода). Таким образом, вы можете проверить гипотезу, предложить ожидаемые результаты и меры контроля (например, гены, которые должны расти и падать), что является гораздо лучшим способом проведения эксперимента NGS (или любого другого эксперимента). Просто ловить гены - это плохой подход, и он всегда вызывает гнев наблюдательного комитета.
- Если просто сказать, что вы будете использовать какое-то программное обеспечение для анализа данных или группировки генов по путям, то это тоже доставит вам неприятности. Данные NGS могут быть чрезвычайно сложными, и для их анализа потребуются статистические методы. Известные данные о путях заражения крайне неполны. В любом случае, большинство генов не задействованы в метаболических путях, поэтому для анализа данных потребуется хорошо спланированный подход. У вас должен быть способ узнать, сработал эксперимент или нет (например, были ли активированы ожидаемые гены апоптоза?).
- Эксперимент NGS не должен быть просто абзацем в конце одной из ваших целей. Что бы вы ни делали, ни в коем случае не добавляйте эксперимент NGS в конец заявки на грант как нечто, что вы «тоже будете делать». Эксперименты NGS большие, дорогие и сложные, и их нельзя проводить на заднем плане. Многие, многие гранты содержат описание эксперимента NGS в один абзац, который также будут проводить исследователи. Это громоотвод для критики со стороны рецензентов.
- Если вы ищете гены, вы должны искать их не зря. Не предлагайте просто искать регулируемые гены, не предлагая что-то с ними сделать. Поиск генов, которые движутся вверх и вниз, не является достаточно важной целью. Вы должны искать гены с определенной целью (например, проверять какую-то гипотезу).